【卡梅德生物】蛋白表达-原核表达系统

柔情只为你懂 2024-05-24 12:41 79阅读 0赞

[原核表达系统][Link 1]相对较简单，但在生物学中起着重要的作用。大肠杆菌表达系统是应用最广泛的原核蛋白表达系统之一。

**大肠杆菌表达宿主：**

作为最早用于重组蛋白表达的宿主菌，大肠杆菌短的增殖时间使其成为一种简单快捷的重组蛋白表达系统。因此, 评估重组基因在大肠杆菌中的表达只需要不到1 周的时间。培养大肠杆菌的培养基价格低廉，而且已有简单直接的方法用于生产过程的放大。

在大肠杆菌中，重组蛋白通常定位于胞质（cytoplasm) 中，也 可以定位于周 质(periplasm) ，在少数情况下会分泌到胞外。定位于胞质的蛋白质的表达效率是最高的。然而，重组蛋白过高的表达可能会导致不溶性蛋白聚集体的累积，从而形成包涵体。不只是真核生物来源的蛋白质会形成包涵体，少数情况下，包括大肠杆菌在内的过表达原核生物来源的蛋白质也会形成包涵体。在大肠杆菌中，蛋白质翻译和折叠的速率比在真核细胞中几乎高10倍，这可能是真核蛋白质形成包涵体的原因。在某些情况下，包涵体大大妨碍了获得可溶的活性蛋白质。

不过，有时包涵体也能带来好处，其不易被蛋白酶降解，易于离心浓缩，很少被其他蛋白质污染，而且通过努力，也能将其再折叠成有活性的可溶性蛋白质。

*E . coli***的温度和分子伴侣：**

作为最重要的原核表达体系，当重组质粒转化进入*E . coli*菌株以后。通过控制温度，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达出的蛋白进行SDS-PAGE/WB 检测，以确定目的蛋白的表达量及表达纯度。在测试蛋白表达状态时会发现包涵体和细胞上清表达并存，几乎没有只有上清表达或者只有包涵体表达的情况；我们想要上清多一些的话那只有降低其翻译速度，主要手段是低温和低浓度的 IPTG 诱导。据推测，降低温度会降低蛋白质转录、翻译和折叠的速率，从而使蛋白质能够正确折叠。此外，研究显示，低温还会降低热休克蛋白酶的活性。一些研究者通过在胞质中与重组蛋白共表达分子伴侣来促进蛋白质的可溶性。该方法的运用似乎具有蛋白质特异性，因此需要针对每种目标重组蛋白分别进行实验。

**融合标签：**

为了提高重组蛋白的可溶性，在其的N 端或 C 端融合可溶性的融合标签。目前，已经证明包括谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦 芽 糖 结 合 蛋 白（M B P )、 N u s A 标签（JV-utilization substrate)、硫氧还蛋白（thioredoxin)及小分子泛素样修饰蛋白(S U M O )等，能够提高重组蛋白的可溶性。其中 G S T 标签 和 M B P 标签还有另外的好处, 可以用做亲和纯化的标签。有多种策略可用于移除重组蛋白的融合标签，广泛的做法是在融合标签和重组蛋白之间插入蛋白酶酶切位点，然后使用特异性的蛋白酶将其切除。有时候，移除标签后重组蛋白可能会变得不可溶，所以必须对这一方法进行谨慎的测试。

**翻译后修饰：**

和真核表达系统相比，大肠杆菌对蛋白质进行翻译后修饰的能力有限。这主要是由于缺少相关酶。例如，大肠杆菌不支持酶介导的N -连接的糖基化 (iVlinked glycosylation)、O-连接的糖基化（O l i n k e d glycosylation) 、酰 胺 化（amidation) 、羟基化 (hydroxylation) 、硫酸化(sulfation)。

研究原核表达系统有助于理解生物基本的遗传和遗传信息流动的机制。

详细信息可参考：www.kmdbioscience.cn/pages/danbaibiaoda.html

[Link 1]: https://www.kmdbioscience.cn/pages/danbaibiaoda.html