《生物分离工程》知识点整理

矫情吗；* 2024-03-24 19:29 95阅读 0赞

**生物分离工程**

**第一章(绪论)**

**生物分离工程的定义和过程**

**生物分离工程定义（名词解释）：**

为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相关硬件设备的总称，指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程。

**过程：**

目标产物捕获

目标产物初步纯化(萃取、沉淀、吸附等方法)

目标产物高度纯化和精制

**细胞分离三种手段 ：** 重力沉降 离心沉降 过滤

**第二章**

**离心分离原理和方法：**

**原理：**离心沉降是在离心力的作用下发生的。

单位质量的物质所受到的离心力：

式中：

r为离心半径，即从旋转轴心到沉降颗粒的距离；

ω为旋转角速度；

N为离心机的转数，s－1

**方法**：（1）差速离心分级

（2）区带离心（差速区带离心 、 平衡区带离心）

**离心分离设备**：

离心力（转速)的大小 ：低速离心机、 高速离心机、 超离心机

按用途：分析性 、制备性

按工业应用 ：管式离心机 、 碟片式离心机

实验室用以离心管式转子离心机 ，离心操作为间歇式

**悬浮液的预处理方法和目的 ：**

**方法 ：**

1.加热：最简单和最廉价的处理方法。黏度、促凝聚、固体成分体积、破坏凝胶结构、增加空隙率

调pH值：方法简单有效、成本低廉

2.凝聚：在凝聚剂(如铝盐、铁盐、石灰和NaCl)作用下，细胞蛋白质等胶体去稳定，并聚集成1mm大小的凝聚块的过程。（机理：破坏双电层，水解后胶体吸附，氢键结合等）

3.絮凝：在絮凝剂高分子聚合电解质的作用下，胶体颗粒和聚合电解质交连成网，形成10mm大小的絮凝团过程。（机理：絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用）

4.惰性助滤剂：一种颗粒均匀、质地坚硬的粒状物质，用于扩大过滤表面的适应范围，减轻细小颗粒的快速挤压变形和过滤介质的堵塞。（ 使用方法：预涂层；按一定比率混合。

助滤剂种类：硅藻土、纤维素、未活化的炭、炉渣、重质碳酸钙等。）

**目的 ：**提高过滤速度和过滤质量是过滤操作的目标。

**各种细胞破碎技术原理和优缺点**：

原理：许多生物产物在细胞培养过程中保留在细胞内，需破碎细胞，使目标产物选择性地释放到液相。破碎的细胞或其碎片去除后，上清液用于进一步的分离纯化。

细胞破碎技术分为：机械破碎法、化学法、物理渗透法

机械法和化学法的比较

机械破碎法缺点：

A、高能、高温、高噪音、高剪切力，易使产品变性失活；

B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难；

C、细胞碎片大小不一，难分离。

化学破碎法缺点：

A、费用高；

B、化学或生化试剂的添加引起新的污染；

C、破碎速度低，效率差，一般只有有限的破碎，常与机械

法连用。

物理渗透法

优点：条件比较温和，有利于目标产物的高活力释放回收。

缺点：破碎效率较低、产物释放速度低、处理时间长、不适于大规模细胞破碎，局限于实验室规模的小批量使用。

**包含体的解决方法（一般步骤）：**

（一）包含体的分离纯化

（二）包含体溶解（可溶性变性、还原蛋白质）

（三）变性蛋白质的复性和重新氧化

（四）蛋白质一般的分离纯化

**第三章**

**沉淀的概念与结晶的区别：**

**沉淀：**

沉淀是物理环境的变化引起溶质溶解度降低、生成固体凝聚物的现象。具有浓缩与分离的双重作用。

**联系：**在本质上都是新相析出的过程，主要是物理变化。

**区别：**结晶为同类分子或离子以有规则排列形式析出；沉淀为不定形的固体颗粒，构成成分复杂，纯度低。

**蛋白质表面性质：**

1.蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区构成。

2.蛋白质水溶液呈胶体性质

3.使蛋白质形成稳定的胶体溶液、凝聚沉淀的因素：水化层和双电层

**影响盐析的因素：**

无机盐（种类、浓度）、温度和pH值

**硫酸铵盐析的特点：**

价格便宜、溶解度大且受温度影响很小、能稳定蛋白质（酶）。

**几种沉淀的方法和优缺点：**

（盐析沉淀、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、热沉淀的原理和优缺点）

1.盐析沉淀 原理

蛋白质溶液的离子强度增大时，蛋白质表面的双电层厚度降低，静电排斥作用减弱。盐离子的水化作用使蛋白质表面疏水区附近的水化层脱离蛋白质，暴露出疏水区域，增大了蛋白质表面疏水区之间的疏水相互作用，容易发生凝集，进而沉淀。

优点：盐析广泛应用于各类蛋白质的初步纯化和浓缩。在某些情况下还可用于蛋白质的高度纯化。

缺点：利用盐析沉淀得到的目标产物中含盐量较高，一般在盐析沉淀后，需进行脱盐处理，才能进行后续的分离操作（如离子交换色谱）。

2.等电点沉淀 原理

蛋白质在pH值为其等电点的溶液中净电荷为零，蛋白质之间静电排斥力最小，溶解度最低。利用蛋白质在pH值等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀的方法称为等电点沉淀。

优点：无需后续的脱盐操作。

缺点：沉淀操作的pH过低时，容易引起目标蛋白质变性。

3.有机溶剂沉淀 原理

向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，水的活度降低。随着有机溶剂浓度的增大，水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低，溶液的介电常数下降，蛋白质分子间的静电引力增大，从而凝聚和沉淀。

优点：有机溶剂密度较低，易于沉淀分离；与盐析法相比，沉淀产品不需脱盐处理

缺点：易引起蛋白质变性，必须在低温下进行

4.热沉淀

在较高温度下，热稳定性差的蛋白质发生变性沉淀。根据蛋白质间热稳定性的差别进行蛋白质热沉淀，分离纯化热稳定性高的目标产物。

**第四章**

**膜分离技术的类型：**

以浓度差为推动力：透析

以电场力为推动力：电渗析

以推动力分类 以静压力差为推动力：微滤；超滤；反渗透

以蒸气压差为推动力的过程：渗透气化

微滤(microfiltration, MF)

超滤(untrafiltration, UF)

反渗透(reverse osmosis, RO)

以分离应用领域分类 透析(Dialysis, DS)

电透析(electrodialysis, ED)

亲和过滤(affinity filtration, AF)

渗透气化(pervaporation, PV)

**分析比较反渗透、纳滤、超滤和微滤的共同点和差别：**

微滤、超滤、纳滤、反渗透**相同点**：

① 膜两侧压力差为推动力；

② 按体积大小而分离；③膜的制造方法、结构和操作方式都类似。

微滤、超滤、纳滤、反渗透**区别**：

① 膜孔径：微滤0.1-10mm > 超滤0.01-0.1m > 纳滤0.001-0.01mm > 反渗透 小于0.001mm

② 分离粒子：微滤截留固体悬浮粒子，固液分离过程；超滤、纳滤、反渗透为分子级水平的分离；

③ 分理机理：微滤、超滤和纳滤为截留机理，筛分作用；反渗透机理是渗透现象的逆过程：

④ 压差：微滤、超滤和纳滤压力差不需很大0.1-0.6 MPa

**渗透气化的原理和应用：**

**原理**：疏水膜的一侧通入料液，另一侧抽真空，使膜两侧产生溶质分压差。在分压差的作用下，料液中的溶质溶于膜内，扩散通过膜，在透过侧发生气化，气化的溶质被膜装置外设置的冷凝器冷凝回收。疏水性较大的溶质易溶于疏水膜，渗透速度高，在透过一侧得到浓缩。

优点：溶质发生相变，透过侧溶质以气体状态存在，因此消除了渗透压的作用，可在较低的压力下进行，适于高浓度混合物的分离。

**用途**：利用溶质之间膜透过性的差别，特别适用于共沸物和挥发度相差较小的双组分溶液的分离。

**不对称膜的结构：**

膜在厚度上的孔道结构不均匀，由起膜分离作用的表面活性层(0.2-0.5µm)和起支撑作用的惰性层(50-100µm)构成。

**浓度极化：**膜分离操作中，所有溶质均被透过液传送到膜表面，不能完全透过膜的溶质受到膜的截留作用，在膜表面附近浓度升高。这种在膜表面附近浓度高于主体浓度的现象称为浓度极化。

**凝胶极化：**当膜表面附近的浓度超过溶质的溶解度时，溶质会析出，形成凝胶层。分离含有菌体、细胞和其他固形成分的料液时，也会在膜表面形成凝胶层。这种现象称为凝胶极化。

**截留相对分子量**：一般将在截留率为90%的溶质分子量定义为膜的截留分子量。

**过滤速度与压力关系：**

流速

传质系数随流速的增大而提高。因此，流速增大，透过通量也增大。

压力

1.当Dp较小时， 无浓度极化层， Jv与Dp成正比，此时：

2.当Dp逐渐增大时，有浓差极化，Jv的增长速率减慢， 此时：

3.当Dp继续增加时，形成凝胶层，且厚度随压力的增大而增大，所以Jv不再随Dp的增加。此时的Jv为此流速下的极限值(Jlim)，用方程：

4.lim随料液浓度上升而下降¯，随流速(搅拌速度) 上升而上升

**第五章**

**问：根据弱电解质的萃取理论分析为什么青霉素在酸性（pH≤2.5）条件下，而红霉素却要在碱性（pH≥9.8）条件下才能被萃取到丁酯中去呢？**

青霉素萃取反萃取

青霉素是有机酸，pH值对其分配系数有很大影响。选择适当的pH，有利于提高青霉素的收率, 还可根据共存杂质的性质和分配系数提高萃取的选择性。

1）青霉素萃取：较低pH下有利于青霉素在有机相中的分配。

2）青霉素反萃取：pH大于6.0时，青霉素几乎完全分配于水相中。

双水相系统是指某些高分子聚合物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相系统。

**双水相系统的概念，及常见的双水相系统：**

双水相系统：是指某些高分子聚合物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相系统。

**蛋白质的分配平衡 ：**静电作用，疏水作用。

**液膜概念及液膜萃取的优点：**

液膜：由水溶液或有机溶剂（油）构成的液体薄膜。液膜可将与之不能互溶的液体分隔开来，使其中一侧液体中的溶质选择性地透过液膜进入另一侧，实现溶质的分离。

优点：液膜萃取可同时实现萃取和反萃取，这是液膜萃取法的主要优点之**一**。

**乳状液膜的膜溶液组成：（填空题）**

膜溶剂、表面活性剂 、添加剂

**液膜萃取三种机理：**

单纯迁移 **、**反萃相化学反应促进迁移、膜相载体输送

**问：为什么反胶团萃取可用于蛋白质类生物大分子的分离纯化？溶解的推动力有哪些？**

反胶团内微水池的水可溶解氨基酸、肽和蛋白质等生物分子，为生物分子提供易于生存的亲水微环境。因此反胶团萃取可用于蛋白质类生物大分子的分离纯化。

溶解推动力有：静电作用、空间相互作用、疏水性相互作用

**超临界流体萃取的概念、优点和用途：**

超临界流体萃取：利用超临界流体为萃取剂的萃取操作称为超临界流体萃取。

优点和用途：超临界流体粘度小、自扩散系数大，萃取速度高于液体萃取，特别适用于提取固体内有用成分。

**超临界流体萃取设备和操作方法：（填空题）**

超临界流体萃取设备通常由溶质**萃取槽**和萃取溶质的**分离回收槽**构成，分别相当于萃取和反萃取。

根据萃取过程中超临界流体的状态变化和溶质的分离回收方式不同，超临界流体萃取操作主要分**等温法、等压法**和**吸附法**。

**第六章**

**三种吸附作用力原理和各自脱附的方法：**

物理吸附：基于吸附剂与溶质之间的分子间力。溶质在吸附剂上吸附与否或吸附量的多少取决于溶质与吸附剂极性的相似性和溶剂的极性。可通过改变温度、pH值和盐浓度等物理条件脱附。

化学吸附：吸附剂表面活性点与溶质之间发生化学键合、产生电子转移现象，吸附稳定，不易脱附。采用破坏化学键合的化学试剂洗脱剂脱附。

离子交换：所用吸附剂称为离子交换剂，表面键合离子基团或可离子化基团，通过静电引力吸附带有相反电荷的离子，吸附过程发生电荷转移。一般通过提高离子强度或调节pH值的方法洗脱。

**离子交换剂的分类：**

1.阳离子交换剂和阴离子交换剂

2.按离子交换剂适用的生物分子大小分类：小分子类交换剂和高分子类交换剂

**固定床单柱吸附操作过程：**

**膨胀床吸附的用途：**分析化学、纯化G6PDH、污染物治理等、医药

**第七章**

**色谱法概念和原理：**

色谱法：是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同，当流动相推动样品中的组分通过固定相时，在两相中进行连续反复多次分配，从而形成差速移动，达到分离的方法。

**色谱分离的分类：（填空题）**

按应用目的分类：**分析性色谱** **、制备性色谱**

按固定相及流动相的状态分类：**气相色谱、 液相色谱、超临界流体色谱**

按压力分类：**低压色谱分离、中压色谱分离、高压色谱分离**

按分离机理分类：**凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相色谱、疏水性相互作用色谱、**

**亲和色谱**

**分配系数：（名词解释）**

，cs和cm分别为组份在固定相和流动相中的浓度。

**保留时间**：**（名词解释）**

试样从进样到柱后出现峰极大点时所经历的时间。可用时间/ 距离/体积单位表示。

**保留体积：（名词解释）**

指从进样开始到被测组份在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相体积。

**柱效与流动相关系**

**柱层析三种方法**

**凝胶过滤层析分配系数、**

**凝胶过滤分配系数、洗脱次数和相对分子量的关系：**

**凝胶过滤色谱操作中溶质的分配系数m只是相对分子质量、分子形状和凝胶结构（孔径分布）的函数，与所用洗脱液的pH值和离子强度等无关。**

蛋白质在凝胶介质中的分配系数随相对分子质量的增大而减小。

**排阻极限：**指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。

**溶胀率：**溶胀后每克干凝胶所吸收的水分的百分数。

**床体积：**1 g干燥凝胶溶胀后的体积。

**凝胶过滤色谱：**

原理：是利用凝胶过滤介质为固定相，根据料液中溶质相对分子质量的差别进行分离的液相色谱法。

应用： 分离纯化、脱盐、相对分子质量的测定

洗脱方法：恒洗脱液洗脱

**离子交换色谱：**

原理：是以离子交换剂为固定相，根据荷电溶质与离子交换剂之间静电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱色谱法。

应用 ：分离纯化生物产物

洗脱方法：线性梯度洗脱法 或 逐次洗脱法。

**反相色谱：（概念）**

反向色谱（RPC）利用表面非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，是根据溶质极性（疏水性）的差别进行分离纯化的洗脱色谱法。

**流通色谱：（概念）**（灌注色谱）

指利用含有大穿透孔的介质为固定相的液相色谱法，其分离模式包括前述的各种吸附色谱。

**羟基磷灰石色谱吸附和洗脱的原理：**

吸附原理：羟基磷灰石色谱(HAP)的吸附主要基于钙离子和磷酸根离子的静电引力，即在HAP晶体表面存在两种不同的吸附晶面，各存在吸附点C和P，分别起阴、阳离子交换作用。

洗脱原理：HAP色谱通常以磷酸盐缓冲液为流动相，采用提高盐浓度的线性梯度脱法

**问：利用疏水性色谱分离A和B的混合物时，在某操作条件下两者分离度不理想，试述如何改善条件，提高分离度，说明理由。**

（1）降低盐浓度：疏水色谱中加入盐有利于蛋白质的吸附，盐浓度越高，吸附容量越大。

（2）加入添加剂（如乙二醇等）：低浓度的添加剂有利于降低蛋白质与配基之间的疏水作用力

（3）降低盐浓度和添加剂同时使用

（4）降低洗脱操作温度或降低洗脱液的PH值：温度升高，疏水作用增强，蛋白质的保留值增加。无论PH比pI大或小，都会使蛋白质带上电荷，此时如填料的配基不带电荷，蛋白质易于洗脱。

\{老师提的几点：（1）换填料（2）增加柱高（3）降低流速（4）降低进料量\}

**第八章**

**生物亲和作用的概念和本质：**

概念：生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力具有排他性。生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用。

本质：具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁孔” 的空间结构关系。

亲和结合作用，还需存在特殊的相互作用力：静电作用、氢键、疏水相互作用、配位键、弱共价键

**亲和色谱原理和操作：**

原理：亲和吸附是利用亲和吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱法。

操作：与一般的固定床吸附操作相似，分**进料**、**杂质清洗**、**目标产物洗脱**和**色谱柱再生**4个步骤。

**亲和色谱填料的制备过程：**一般包括**载体的选择、载体的活化和配基的连接**。

**特异性和非特异性洗脱的特点：**

**特异性**洗脱利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产物。

例如：Lys和Arg均为t-PA的抑制剂，利用固定化Lys为配基亲和分离t-PA时，可用Arg溶液进行洗脱。

优点：洗脱条件温和，有利于保护产物的生物活性；由于仅特异性洗脱目标产物，对于特异性较低的亲和体系或非特异性吸附较严重的物系，有利于提高目标产物的纯度。

**非特异性**洗脱通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是使用较多的洗脱方法。

**第九章**

**等电点聚焦的概念和原理：**

原理：等电点聚焦利用蛋白质和氨基酸等两性电解质具有等电点，在等电点的pH值下呈电中性，不发生泳动的特点进行电泳分离。

**双向电泳的概念和原理：**

概念：双向电泳同时利用分子尺寸和等电点这两种性质的差别进行蛋白质等生物大分子的分离，即将普通凝胶电泳和等电点聚焦相结合，使溶质在二维平面上得到分离。

原理：如图**：**在凝胶电泳槽的y方向上凝胶具有逐渐增大的浓度分布， x方向上具有pH梯度。

ü **x方向上**电泳，使溶质分子以**等电点聚焦的形式**泳动到其等电点处。

ü 然后将适当pH值的缓冲液渗透到凝胶中，在**y方向上**加电场使溶质再次泳动。此时溶质之间的泳动速度受**荷电量及相对分子质量**的影响，相互之间得到进一步的分离。

**不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳概念及其分离的原理：**

凝胶层由浓度不同的两层凝胶组成：**浓缩胶**(溶质在此层得到浓缩)和**分离胶**(各个组分根据迁移率的差别分离)。

**不连续性**表现在：

1） 凝胶孔径不连续性：

2） 缓冲体系离子组成及pH值的不连续性：

3） 电位梯度的不连续性：

在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即样品的**浓缩效应**，凝胶的**分子筛效应和电荷效应**，由于这三种物理效应，使样品分离。

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